【三代纳米孔专题】之优化篇—Nanopore在HPV分型及整合位点检测中的应用
人类乳突病毒（human papillomavirus, HPV）在分类学上包含超过200种病毒，这些病毒可以感染人体的不同部位。HPV病毒的感染在日常生活中十分普遍，不过大部分HPV感染可以被人体自身的免疫系统清除，不会诱发癌症等恶性疾病。只有少数几种HPV在长时间感染后可能诱发人体多种癌症，例如宫颈癌、头颈癌、鳞状细胞癌、口腔癌等。
根据感染人体后与癌症发病的相关性，HPV病毒可以分为两类：高危型 HPV（high-risk HPV）和低危型 HPV（low-risk HPV）。低危型 HPV感染可能导致良性病变，在口腔、咽喉等部位产生疣体。而高危型HPV 持续多年感染可导致恶性病变。
现在研究表明宫颈癌及其前期病变的发生与宫颈高危型HPV病毒感染关系密切。在超过200种的HPV病毒中，只有14种是高危型HPV，其中HPV16型和HPV18型是多种癌症发病的重要因素[1]。通过HPV分型检测可以得到感染的HPV种类的信息，有无高危型HPV感染，是单一型HPV感染还是多种HPV同时感染，对后续临床治疗具有指导意义。
Nanopore+HPV分型
现在HPV分型检测可以通过测序完成，基本检测分析流程为：样品采集-富集HPV特征DNA-测序-HPV分型分析。其中，富集方法包括杂交捕获、PCR扩增和全基因组建库等，主要应用的测序平台为NGS平台，将得到HPV的序列信息与数据库相比较，从而确定具体HPV的分型。而nanopore相较NGS测序技术，可以在测序的过程中实时得到分型信息，大大提高检测效率，缩短患者的等待时间。同时nanopore测序技术得到的序列读长远远大于二代测序的读长，长读长可以提高分型结果的准确性，更利于HPV分型分析[2]。
图1. Nanopore测序示例图
Nanopore+整合位点检测
高危型HPV感染诱发癌症的机理仍在研究中，现有研究认为与HPV基因组整合到人体基因组中有关。在HPV病毒感染人体后，人体自身的免疫系统如果没有快速将HPV病毒清除，病毒会利用人体体细胞进行复制装配产生更多的病毒。在病毒复制的过程中，HPV基因组可能整合到人体基因组中。
研究统计，大部分HPV整合发生在人体基因的内含子和基因间序列中，也可能整合到人体基因的外显子和调控序列中。如果整合发生在外显子和调控序列中，HPV可以直接作用于人体基因的表达调控中，从而诱发恶性病变。随着感染时间的增加，整合发生在这些关键位置的几率就会增加，从而诱发恶性病变。HPV整合到人体基因组的同时，还可能造成人体基因组的结构变异，比如基因组缺失、重排、倒置等[3-5]。
图2. 由于整合可能导致关键细胞基因去调控的机制示例
二代测序的方法可以检测出HPV在人体基因组上的整合位点，以及整合位点处是否有致癌基因，以大量应用的到HPV相关研究中。但对于复杂的结构变异，NGS是无能为力的。而nanopore通过测序读长长的优势，不单单可以得到整合位点与致癌基因的信息，还可以对基因组结构变异进行分析，甚至可能得到HPV整合到人体基因组上的完整片段。在未来，结合nanopore在甲基化检测方面的优势，我们相信是可以更好的揭示HPV诱发癌症的分子机理[6, 7]。
小结
综上，元码基因利用nanopore实时检测分析、长读长以及在甲基化修饰等方面的优势，已开展HPV分型以及相关研发工作，为更好更快地鉴定HPV病毒种类、探究后续机理不懈精进。
参考文献：
1.NIH.https://www.cancer.gov/about-cancer/causes-prevention/risk/infectious-agents/hpv-and-cancer.
2. Gradissimo A, Burk RD. Molecular tests potentially improving HPV screening and genotyping for cervical cancer prevention. Expert review of molecular diagnostics. 2017;17(4):379-91.
3. Hu Z, Zhu D, Wang W, Li W, Jia W, Zeng X, et al. Genome-wide profiling of HPV integration in cervical cancer identifies clustered genomic hot spots and a potential microhomology-mediated integration mechanism. Nature genetics. 2015;47(2):158-63.
4. Zhang R, Shen C, Zhao L, Wang J, McCrae M, Chen X, et al. Dysregulation of host cellular genes targeted by human papillomavirus (HPV) integration contributes to HPV-related cervical carcinogenesis. International journal of cancer. 2016;138(5):1163-74.
5. Li T, Unger ER, Rajeevan MS. Universal human papillomavirus typing by whole genome sequencing following target enrichment: evaluation of assay reproducibility and limit of detection. BMC genomics. 2019;20(1):231.
6. Norris AL, Workman RE, Fan Y, Eshleman JR, Timp W. Nanopore sequencing detects structural variants in cancer. Cancer biology & therapy. 2016;17(3):246-53.
7. Anne Van Arsdale MD MS JLP, Nicole Patternson, Elaine Maggi, Mark H. Einstein MD MS, Dennis Y. KuoMD, and Cristin Montagna PhD. Elucidation of integrated HPV DNA structure in a cervical carcinoma cell line by combined high resolution and long range sequencing analyses. 2018.